人大细胞肺癌H460绿色荧光标记肿瘤模型

一、 大细胞肺癌

大细胞肺癌起源于支气管粘膜上皮，局限于基底膜内者称为原位癌。癌肿可向支气管腔内或和临近的肺组织生长，并可通过淋巴、血行或经支气管转移扩散。其生长速度和转移扩散的情况与具体的组织学类型、分化程度等生物学特性有一定关系。大细胞肺癌常发生于肺上叶，多为周围型，体积较大，边界清楚，分叶，少见空洞。根据其病理类型可分为4类：（1）大细胞神经内分泌癌 这是一类显示神经内分泌分化的大细胞癌。细胞较大，呈多角形，胞质嗜酸，核多形，核仁较明显，核分裂像多见，常见大面积坏死。免疫组化染色，神经内分泌标记阳性，电镜下可见神经内分泌颗粒；（2）基底细胞样癌 细胞较大，立方形或梭形，分叶状或实性巢状排列，周边部癌细胞呈栅栏状排列；（3）淋巴上皮瘤样癌 罕见。组织形态与鼻咽部淋巴上皮瘤样癌相同。癌细胞打，泡状核，核仁明显，细胞成片或呈巢状，癌巢内及间质中有淋巴细胞侵润；（4）透明细胞癌罕见。瘤细胞打，多角形，胞质透明或泡沫状，无粘液，伴或不伴糖原。伴横纹肌样表型的大细胞癌罕见。细胞核大，多形性，胞质丰富，有嗜酸性小球，免疫组织化学既表达上皮性抗原，也显示横纹肌表型。

二、 临床表现及致病机理

肺大细胞癌的临床症状及表现与其他类型肺癌相似，均表现为咳嗽、咯血、胸痛等症状，晚期肺癌压迫邻近器官、组织或发生远处转移时，可以产生：①压迫或侵犯膈神经，引起同侧膈肌麻痹。②压迫或侵犯喉返神经，引起声带麻痹声音嘶哑。③压迫上腔静脉引起面部、颈部、上肢和上胸部静脉怒张、皮下组织水肿、上肢静脉压升高。④侵犯胸膜，可以引起胸腔积液，多为血性。⑤癌肿侵入纵隔，压迫食管，可引起吞咽困难。⑥上叶顶部肺癌，亦称Pancoast肿瘤或肺上沟瘤，可以侵入和压迫位于胸廓上口的器官或组织，如第一肋骨、锁骨上动脉和静脉、臂丛神经、颈交感神经等，产生胸痛、颈静脉或上肢静脉怒张、水肿、臂痛和上肢运动障碍，同侧上眼睑下垂，瞳孔缩小，眼球内陷，面部无汗等颈交感神经综合征。少数癌肿产生内分泌物质，临床上呈现非转移性的全身症状：如骨关节综合征（杵状指、关节痛、骨膜增生等）、Cushing综合征、重症肌无力、男性乳腺增大、多发性肌肉神经痛等肺外症状。这些症状在切除肺癌后可能消失。但大细胞还有另外的临床特点：（1）病程短、易侵犯相邻肺叶：肺大细胞癌较之鳞癌和腺癌分化差、增殖快、病程短，且肺大细胞癌呈侵袭性生长，发展迅速，是高度恶性神经内分泌肿瘤，早期即可出现淋巴和血行转移，易侵及相邻肺叶；（2）肺大细胞癌好发于男性重度吸烟者：吸烟与肺癌的关系众所周知，在我国男性吸烟者比率也是大于女性吸烟者，因此在临床上肺大细胞癌大多为男性，且均有长期吸烟史；（3）以周围型病变多见：在放射学检查时，肺部肿瘤周围型病变多见，约占80%以上，肿块未密度均匀的团块状阴影，无空洞形成，肿瘤周围欠规则，且肿块巨大，直径在8cm以上，常伴纵膈淋巴结转移。

大细胞肺癌和其他病理类型的肺癌一样，确切的发病原因至今尚欠了解。经过多年的大量调查研究，目前认为与下列因素有密切关系：（1）吸烟 几乎所有肺癌患者的发病与吸烟有关。吸烟者肺癌死亡率比不吸烟者高10-13倍。吸烟量越多，吸烟年限越长，开始吸烟年龄越早，肺癌死亡率越高。戒烟持续15年才与不吸烟者相近。吸纸烟者比吸雪茄，烟斗者患病率高。纸烟中含有各种致癌物质，如苯并芘，为致癌的主要物质。被动吸烟也容易引起肺癌。女性中丈夫吸烟者肺癌危险性增加50%。上海市区的一项调查表明，本人不吸烟而与吸烟的丈夫生活在一起的妇女，肺癌危险性平均升高19%，长期与重度吸烟的丈夫生活者，危险性可升高30%。（2）职业致癌因子 已被确认的致人类肺癌的职业因素包括石棉，无机砷化合物、二氯甲醚、铬及其他化合物，镍冶炼，氡及氡子体，芥子体，氯乙烯，煤烟、焦油和石油中的多环芳烃，烟草的加热产物等。在石棉厂工作的吸烟工人肺癌死亡率为一般吸烟者的8倍，是不吸烟也不接触石棉者的92倍。可见石棉有致癌的作用，还说明吸烟与石棉有致癌的协同作用。（3）空气污染 包括室内小环境和室外大环境污染。如室内被动吸烟、燃料燃烧和烹调过程中可能产生的致癌物。有资料表明，室内用煤，接触煤烟或其不完全燃烧物为致癌的危险因素，特别是对女性腺癌。烹调时加热所释放出的油烟雾也是致癌因素，不可忽视。有报道，烹调时处于烟雾弥漫的室内的女性患肺癌的危险度比处于无或少烟雾室内的女性越高60%，且接触烹饪油烟的次数越多、年限越长，患肺癌的危险性越大。城市中汽车废气、工业废气，公路沥青都有致癌物质存在。其中主要是苯并芘。（4）电离辐射 大剂量电离辐射可引起肺癌。辐射的不同射线产生的效应也不同。一般人群中电离辐射来源约49.6%来自自然界，44.6%为医疗照射，来自X线诊断的电离辐射可占36.7%。（5）饮食与营养大量研究显示维生素A、B、C、E及β胡萝卜素能够抑制化学致癌物诱发的肿瘤。一些调查报告认为摄取食物中维生素A含量少或血清维生素A含量低时，患肺癌危险性增高。（6）肺部既往疾病史 大量流行病学调查表明，在对吸烟等混杂因素进行调整后，肺部疾病史（如肺结核、慢性支气管炎等）尤其是结核瘢痕者，男性患肺癌的危险是正常人群的5倍，女性患肺癌的危险是常人群的10倍。（7）遗传因素 一个人患肺癌不仅与环境因素有关，而且遗传因素也起着重要作用。中青年人罹患肺癌的主要危险因素是遗传和吸烟。日本学者进一步就不同组织类型的发病情况进行遗传流行病学研究，发现35..8%的肺鳞癌患者有肺癌家族史，与其他人群相比有显著差别；58.3%的肺泡细胞癌的女性患者有肺癌家族史，并且她们中3/4的人双亲患有肺癌。遗传因素是女性肺癌的重要危险因素，不仅支持了肺癌的家族史增加个体患肺癌的危险性，而且也说明了女性对肺癌的遗传易感性比较高。（8）社会心理因素 有关肺癌患者与发病前心理社会因素关系的兵力对照研究提示，精神长期压抑者OR值为4.14，按人口暴露率8.8%计算，其人群归因危险度为21.6%。北京市肿瘤防治研究所对北京市近郊区350例肺癌进行1:1配对病例对照研究，发现北京市肺癌效应较强的多种危险因素，即呼吸系统疾病，吸烟史、污染源、家族肿瘤史、家庭不和及精神创伤等式导致肺癌的主要原因。不良生活事件引起癌症的机制尚未阐明，一般认为不良生活事件使机体产生应激，出现抑郁、忧虑、悲伤、紧张、愤怒或焦虑等负性情绪。过度或持续的应激会导致机体内环境失衡，免疫功能紊乱而发生癌症。（9）其他危险因素 如内分泌状况、免疫状态、体重指数等与肺癌有一定关系；女性肺腺癌与雌激素水平有关等。

三、 模型背景

H460细胞系于1982年由A.F. Gazdar自一个男性大细胞肺癌患者的胸腔积液中培养获得。与普通肺癌细胞相比，该细胞具有较高水平的p53 mRNA的表达并且无总DNA结构异常。免疫酶标染色显示，该细胞具有角蛋白和波形蛋白阳性反应，但神经丝三联体蛋白反应阴性。该细胞是人亚三倍体细胞系，典型的染色体数是57,或者58条染色体数细胞也存在一定的比例，X和Y染色体在所有细胞中都存在2个拷贝数。

无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/C-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/C-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/C-nu/+）。采用BALB/C-nu/+♀与BALB/C-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，窝平均仔鼠成活3.62只，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB／CA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

1. 细胞培养：H460细胞为本实验室冻存

2. 构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

图1绿色荧光表达载体的构建

3. 细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染H460细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2绿色荧光标记的H460-eGFP细胞系（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4. 肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。

图1 皮下接种H460-GFP肿瘤生长影像分析

图2 荧光标记肿瘤生长曲线

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第5周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大，荧光光子数也逐渐增加，移植瘤体积与荧光光子数成正相关（图1、图2）。

该小动物模型饲养在清洁级动物中，微生物处于监控状态，动物房有相应的保护措施，小鼠不会出现逃逸，不会对外界环境造成影响。