人食管癌细胞EC9706绿色荧光标记BALB／CA-nu裸小鼠模型

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。男多于女，发病年龄多在40岁以上。食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。

食管癌的人群分布与年龄、性别、职业、种族、地域、生活环境、饮食生活习惯、遗传易感性等有一定关系。经已有调查资料显示食管癌可能是多种因素所致的疾病。已提出的病因如下：

1.化学病因

亚硝胺。这类化合物及其前体分布很广，可在体内、外形成，致癌性强。在高发区的膳食、饮水、酸菜、甚至病人的唾液中，测亚硝酸盐含量均远较低发区为高。

2.生物性病因

真菌。在某些高发区的粮食中、食管癌病人的上消化道中或切除的食管癌标本上，均能分离出多种真菌，其中某些真菌有致癌作用。有些真菌能促使亚硝胺及其前体的形成，更促进癌肿的发生。

3.缺乏某些微量元素

钼、铁、锌、氟、硒等在粮食、蔬菜、饮水中含量偏低。

4.缺乏维生素

缺乏维生素A、维生素B2、维生素C以及动物蛋白、新鲜蔬菜、水果摄入不足，是食管癌高发区的一个共同特点。

5.烟、酒、热食、热饮、口腔不洁等因素

长期饮烈性酒、嗜好吸烟，食物过硬、过热、进食过快，引起慢性刺激、炎症、创伤或口腔不洁、龋齿等均可能与食管癌的发生有关。

6.食管癌遗传易感因素。

食管癌的临床表现也根据发病时间病情分为早期和中晚期：

1.早期

症状常不明显，但在吞咽粗硬食物时可能有不同程度的不适感觉，包括咽下食物梗噎感，胸骨后烧灼样、针刺样或牵拉摩擦样疼痛。食物通过缓慢，并有停滞感或异物感。梗噎停滞感常通过吞咽水后缓解消失。症状时轻时重，进展缓慢。

2.中晚期

食管癌典型的症状为进行性咽下困难，先是难咽干的食物，继而是半流质食物，最后水和唾液也不能咽下。常吐黏液样痰，为下咽的唾液和食管的分泌物。患者逐渐消瘦、脱水、无力。持续胸痛或背痛表示为晚期症状，癌已侵犯食管外组织。当癌肿梗阻所引起的炎症水肿暂时消退，或部分癌肿脱落后，梗阻症状可暂时减轻，常误认为病情好转。若癌肿侵犯喉返神经，可出现声音嘶哑；若压迫颈交感神经节，可产生Horner综合征；若侵入气管、支气管，可形成食管、气管或支气管瘘，出现吞咽水或食物时剧烈呛咳，并发生呼吸系统感染。最后出现恶病质状态。若有肝、脑等脏器转移，可出现黄疸、腹腔积液、昏迷等状态。

体格检查时应特别注意锁骨上有无增大淋巴结、肝有无包块和有无腹腔积液、胸腔积液等远处转移体征。

食管癌EC9706细胞系来源于中国人蕈伞型高分化食管鳞癌，贴壁生长。

无胸腺裸鼠（Nude Mouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/C-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/C-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/C-nu/+）。采用BALB/C-nu/+♀与BALB/C-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，窝平均仔鼠成活3.62只，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB／CA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

1 细胞培养：EC9706细胞为本实验室冻存

2 构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin- promoter-eGFP

图1绿色荧光表达载体的构建

3 细胞转染和筛选：采用Lipofectamine 2000 Reagent转染EC9706细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养（图2）。

图2绿色荧光标记的EC9706细胞系（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图2)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4 肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。

图1 荧光标记肿瘤生长曲线

图2 皮下接种EC9706-GFP肿瘤生长影像分析

对数生长期的GFP标记EC9706肿瘤细胞悬液皮下种于BALB／cA-nu小鼠，分别在接种的7、14、21、28和35d观察肿瘤的生长情况。从第1周至第5周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大，荧光光子数也逐渐增多，与肿瘤面积的生长成正比。

该小动物模型饲养在清洁级动物中，微生物处于监控状态，动物房有相应的保护措施，小鼠不会出现逃逸，不会对外界环境造成影响。