人宫颈癌Hela绿色荧光标记BALB／c裸小鼠模型

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。常见有鳞癌、腺癌和腺鳞癌三种类型。（1）鳞癌：按照组织学分化分为Ⅲ级。Ⅰ级为高分化鳞癌，Ⅱ级为中分化鳞癌（非角化性大细胞型），Ⅲ级为低分化鳞癌（小细胞型），多为未分化小细胞。（2）腺癌：占宫颈癌15%～20%。主要组织学类型有2种。①黏液腺癌：最常见，来源于宫颈管柱状黏液细胞，镜下见腺体结构，腺上皮细胞增生呈多层，异型性增生明显，见核分裂象，癌细胞呈乳突状突入腺腔。可分为高、中、低分化腺癌。②恶性腺瘤：又称微偏腺癌，属高分化宫颈管黏膜腺癌。癌性腺体多，大小不一，形态多变，呈点状突起伸入人宫颈间质深层，腺上皮细胞无异型性，常有淋巴结转移。（3）腺鳞癌：占宫颈癌的3%～5%。是由储备细胞同时向腺细胞和鳞状细胞分化发展而形成。癌组织中含有腺癌和鳞癌两种成分。

早期宫颈癌常无明显症状和体征，宫颈可光滑或难与宫颈柱状上皮异位区别。颈管型患者因宫颈外观正常易漏诊或误诊。随病变发展，可出现以下表现：（1）阴道流血：早期多为接触性出血；中晚期为不规则阴道流血。出血量根据病灶大小、侵及间质内血管情况而不同，若侵袭大血管可引起大出血。年轻患者也可表现为经期延长、经量增多；老年患者常为绝经后不规则阴道流血。一般外生型较早出现阴道出血症状，出血量多；内生型较晚出现该症状。（2）阴道排液：多数患者有阴道排液，液体为白色或血性，可稀薄如水样或米泔状，或有腥臭。晚期患者因癌组织坏死伴感染，可有大量米汤样或脓性恶臭白带。（3）晚期症状：根据癌灶累及范围出现不同的继发性症状，如尿频、尿急、便秘、下肢肿痛等；癌肿压迫或累及输尿管时，可引起输尿管梗阻、肾盂积水及尿毒症；晚期可有贫血、恶病质等全身衰竭症状。

人类乳头瘤病毒（HPV）感染在宫颈癌病因中具有重要作用，是宫颈癌发生最主要的危险因素。宫颈癌发生的中心环节是人乳头状瘤样病毒E6、E7蛋白与细胞癌基因和抑癌基因相互作用导致相关癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表达和机体免疫调节机制失衡等一系列病理改变引起细胞永生化而癌变。在浸润前或浸润期宫颈癌中存在HPV16、18、31和33型，宫颈良性扁平疣中存在HPV6和11型。美国513例宫颈癌患者的两年随访发现HPV感染消退者为25％，持续不变者为60％，加重者为14％。几个癌基因对宫颈癌的发生是有关的，如c-myc基因过度表达，远处转移的危险性估计增加了6倍，ras基因表达增加与淋巴结转移有关。宫颈癌常呈局部扩散和淋巴结转移，肿瘤蔓延至阴道上段、宫旁、膀胱和直肠是最常见的部位。宫颈癌早期可向外侧和后方延伸，累及主韧带和宫骶韧带。肿瘤扩展至宫旁，一侧或双侧输尿管阻塞，导致肾盂积水和尿毒症是常见的晚期症状。晚期病例可直接扩散至膀胱或直肠，肿瘤浸润或穿透可导致腹腔内扩散和侵犯小肠。一旦发生淋巴血管浸润，肿瘤栓可进入宫旁、盆腔、主动脉旁淋巴结。晚期病例通过胸导管可累及左侧锁骨上淋巴管。淋巴管阻塞可导致双侧淋巴管水肿和转移至腹股沟和外生殖器。血运扩散是直接由毛细血管或浸润或通过交通的淋巴血管间隙引起。

Hela细胞是典型的永生化细胞系，是人上皮细胞，源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞，此细胞株是由正常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒 (Human Papillom avirus 18或HPV 18 )转型成癌细胞的，而且和正常子宫颈癌细胞有许多不同，此细胞显角蛋白免疫沉淀染色阳性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB表达和p53的低水平表达。该细胞是一种体外培养环境中仍具有接触抑制行为的贴壁细胞，然而接触抑制行为的丧失是细胞癌变的表现之一，即细胞能够在实验动物中成瘤，并且可成多层生长。因此，Hela细胞在实验动物中不具有致瘤性，但是病毒致癌基因的转入能够使其具备实验动物成瘤性。Hela细胞具有82条染色体，其中12号染色体4个拷贝数，6、8及17号染色体3个拷贝数。

无胸腺裸鼠（NudeMouse，简称裸鼠）目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，目前已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。由于裸鼠的免疫缺陷，在一定情况下，不排斥来自异种动物的组织移植。因此可作移植人类恶性肿瘤的接受体。根据T.Fogh等1979～1980年的报导，已有150株人的瘤细胞和人体原发癌移植于裸鼠获得成功，目前已成功地将人结肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、肾癌、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠、获得了一定百分比（35.7%）的良好生长，并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后的成活率更高（41%）。

本实验中所用鼠种BALB/c-nu/nu，系1973年从丹麦引入日本中央实验动物所研究。继续培育三年后，交由日本CLEA株式会社进行生产。1980年由CLEA引入。雄鼠是无胸腺裸鼠（BALB/c-nu/nu），雌鼠是有胸腺的杂合小鼠（BALB/c-nu/+）。采用BALB/c-nu/+♀与BALB/c-nu/nu♂随机交配法进行繁殖，已取得较好成果，裸鼠的生产性能良好：受胎率达81.5%，平均产仔率8.1只/窝，平均产裸仔率3.99只/窝，每窝平均成活3.62只仔鼠，9周龄仔鼠成活率100%，其主要项目数据与日本中央实验动物研究所（CLEA）和英国实验动物中心（LAC）发表的材料基本一致。

模型制作采用BALB／cA-nu裸小鼠，鼠龄5周，体重15-18g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

1 细胞培养：Hela细胞为本实验室冻存

2 构建带有筛选标记的载体：chicken-β-actin-promotor-eGFP

3 细胞转染和筛选：采用Lipofectamine2000 Reagent 转染Hela细胞。转染后，用含G418的培养液筛选细胞，获得稳定表达GFP的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养。

图1 表达GFP的Hela细胞株（200×）

稳定高表达GFP的细胞，在荧光显微镜下均呈强荧光，并且荧光较均匀的分布于整个细胞内。单克隆GFP细胞在无G418筛选压力下，传代数次后仍能稳定高水平表达GFP(图1)。细胞形态和未转染细胞无明显区别。

4 肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的高表达细胞株，进行裸鼠皮下接种，采用活体荧光影像系统摄像动态观察。每周观察一次，裸鼠麻醉后放入活体荧光系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析

5 肿瘤体积测定：在接种的14、21、28和35d，分别用游标卡尺测量肿瘤块3个互相垂直直径A、B、C，代入下式计算肿瘤块的体积V：V=1／6πABC(V为体积，A、B、C为瘤体的3个互相垂直的直径)，并绘制肿瘤的生长曲线。

6 肿瘤组织的HE和TUNEL染色：肿瘤生长5周后，剥取出移植瘤，制成石蜡切片并进行HE和TUNEL染色

图1 皮下接种Hela-GFP肿瘤生长影像分析

图2 荧光标记肿瘤的生长曲线

应用小动物活体荧光成像系统可监测到绿色荧光蛋白在裸小鼠皮下的稳定表达，从第1周至第3周，随着肿瘤移植时间的增加，表达绿色荧光蛋白的面积逐渐增大，荧光光子数也逐渐增加，移植瘤体积与荧光光子数成正相关。4周后，由于动物的皮下肿瘤出现了坏死，因此尽管肿瘤体积仍在增加但平均荧光光子数反而呈下降趋势，移植瘤体积与荧光光子数不再有相关性(图1，图2)

1 肿瘤体积测定结果

图3 Hela移植模型肿瘤卡尺测定结果

1周时肿瘤大小不能用游标卡尺测量，2周时肿瘤进入对数生长期，至5周时移植瘤体积可达474．08 mm ，3周时动物皮肤表面都出现了不同程度的坏死。

2 肿瘤组织的HE及TUNEL染色

图4 肿瘤组织的HE染色（A，400×）和TUNEL染色（B，400×）

HE染色可见部分肿瘤细胞核染色质匀细，核浆比例大，细胞结构完整，处于分裂期的细胞很少，肿瘤生长速度缓慢。另外，大部分细胞呈现核皱缩、浓染，胞质致密、嗜酸性染色增强(图5A)。肿瘤组织经TUNEL染色，核呈棕黄色，核固缩，染色质凝集成块状或边集，呈现细胞凋亡的特征(图4B)。

该小动物模型饲养在清洁级动物中，微生物处于监控状态，动物房有相应的保护措施，小鼠不会出现逃逸，不会对外界环境造成影响。