SHIVchn19p4静脉途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human ImmunodeficiencyVirus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研究、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV与SIV毕竟是两种不同的病毒，它们在基因序列、包膜结构和抗原性之间存在一定差异，使该模型的使用有一定的局限性。近年来，人们应用分子生物学技术，将HIV-1重要基因与SIV做成嵌合体病毒（SIV/HIV-1，简称为SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。

包含中国HIV-1CRF_07BC主要流行株env基因的SHIVchn19是由香港大学陈志伟教授构建的，经猪尾猴和印度恒河猴体内系列传代分离出致病突变株SHIVchn19p4，其最重要的生物学特性就在于其CCR5受体特异性，在艾滋病粘膜感染机制研究方面具有极其重要的作用。且由于它具有中国流行株的env基因，相比其他包含中国主要流行株B’/C重组亚型的弱SHIV毒株，如SHIV-XJ02170、SHIVCN97001等来说，在针对中国流行株设计的AIDS疫苗的评价发面具有无可比拟的优势。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为充分模拟静脉注射吸毒人群的感染方式，通过静脉途径，病毒直接感染血液中的靶细胞，从而制备静脉途径艾滋病恒河猴感染模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SHIVchn19p4中国恒河猴细胞适应株，TZM-bl细胞检测病毒感染效价为1.5×104 TCID50/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：猴G0601V和G0602V经后肢静脉感染1ml (1×104 TCID50/ml)病毒。

4、 SHIVchn19p4静脉感染猴样品采集和指标测定：在感染前和感染后4、7、9、11、14、18、21、28、35、42、49、56、70、84及120d采集猴静脉血3ml（EDTA抗凝），用于外周血病毒载量、CD4+细胞绝对数及总结合抗体滴度测定。

5、 SHIVchn19p4静脉感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SHIVchn19p4静脉感染猴外周血CD4+绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

7、 SHIVchn19p4静脉感染恒河猴外周血总结合抗体滴度检测：恒河猴血浆样品从1：2开始2倍连续稀释后，用“人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）”检测交叉性体液免疫反应，高于Cut-off值的最大血浆稀释度定义为SHIV特异性总结合抗体滴度。

1、 SHIVchn19p4静脉感染恒河猴外周血病毒载量结果

G0601V猴和G0602V猴均在感染后9d检测出病毒载量约为105copies/mL，两只猴分别于19d和16d出现病毒载量高峰，峰值约为106copies/mL。G0601V猴在感染后40d载量下降至最低，至感染后84d载量维持在104 copies/ mL。G0602V猴在感染后33d-84的载量维持在104 copies/ mL（图1）。

图1 SHIVchn19p4静脉感染中国恒河猴外周血病毒载量结果

Fig.1 Theviremia (viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaquesinfected intravenously with SHIVchn19p4

1、 SHIVchn19p4静脉感染恒河猴CD4+细胞绝对数结果

G0601V猴CD4+ T 细胞数在SHIVchn19p4感染后围绕1300个/ul水平波动；G0602V猴 CD4+T细胞数在SHIVchn19p4感染后围绕1550个/ul水平上下波动（图2）。

图2 SHIVchn19p4静脉感染中国恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞绝对数

Fig.2 The CD4+ T cell counts (per l blood) inChinese-original rhesus macaques infected intravenously with SHIVchn19p4

1、 SHIVchn19p4静脉感染恒河猴外周血总结合抗体滴度测定

G0601V猴的抗体在感染后19d开始出现，于感染后40d达到峰值，随后维持在较高水平；G0602V猴的抗体在感染后12d开始出现，随后抗体水平不断增高，直至感染后84d与G0601V猴的抗体水平较为接近（图3）。

图3 SHIVchn19p4静脉感染中国恒河猴外周血总结合抗体滴度测定

Fig.3 The bindingantibody in peripheral blood in Chinese-original rhesus macaques infectedintravenously with SHIVchn19p4

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。