胰蛋白酶致小鼠COPD模型

1. 研究目的及意义

本实验动物造模方法采用噁唑酮（oxazolone, OXZ）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）序贯给药灌肠，诱导制备小鼠迁延性溃疡性结肠炎模型，区别于单用噁唑酮或2,4,6-三硝基苯磺酸等化学药品造成的急性模型，症状和病理变化仅维持3-5天，而本方法可维持1-2个月，大大的延长了模型的持续时间，同时也提高了造模的稳定性和所模拟疾病特征性病变的持久性，更符合临床溃疡性结肠炎慢性迁延、反复发作的特征，对开展溃疡性结肠炎病因、病机和治疗药物的相关动物实验研究具有重要意义。

2. 溃疡性结肠炎动物模型的国内外研究进展

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）又称慢性非特异溃疡性结肠炎，与克罗恩病同属于炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）[1-2]，其病因及发病机制至今尚未明确，目前国内外研究主要集中于免疫、遗传、环境及感染等因素，患者临床以粘液、脓血便等消化系统的症状为主，病情反复发作，迁延不愈，严重影响着患者的生活质量，甚至可能导致结肠癌[3]。UC的显微镜下病理特征主要为：隐窝结构异常，上皮细胞异常以及炎症浸润。黏膜炎症弥漫性分布，发病时主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重，并出现血沉、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞的增多[4]。人类溃疡形成是个缓慢的过程，由于其难愈性、易复发性的特点而成为现代难治性疾病之一。目前关于该疾病的实验室研究模型尚不成熟，且多为急性损伤和病理模拟，缺乏良好的慢性长期的动物模型，无法准确的反映人类临床UC慢性迁延、反复发作的特点[5]。建立UC动物模型实验动物的选择很广泛，大鼠、小鼠、兔等多种实验动物都可，但方法各不相同。目前存在的造模方法有如下几种：

2.1 化学法

2.1.1 乙酸刺激

杨永刚[6]等人采用乙酸灌肠成功建立溃疡性结肠炎模型，张忠[7]用经肛门注入0.5 g/L肥皂水0.15 mL, 约30 min后用2g/L戊巴比妥钠经腹腔麻醉，插入直径3 mm的聚乙烯纤维导管至小鼠直肠内深度约为1~2 cm，注入8%乙酸溶液0.15 mL的方法，结果乙酸组结肠黏膜上皮细胞萎缩、坏死、脱落，成肠壁变薄，皱襞消失，黏膜下淋巴细胞增生并有淋巴滤泡形成。张晓峰[8]研究发现乙酸诱导UC动物模型的作用机理与乙酸直接刺激使血管通透性增加，激肽激活，溶解纤维蛋白活性增加以及凝血机制障碍有关。乙酸诱导UC模型制作方法简单，成本低，短期内可使小鼠出现UC明显的症状及典型病理变化，是目前实验性UC模型中应用最广泛的模型之一，适合于临床研究UC的发病机制以及新药的研制开发。但由于乙酸直接刺激造成结肠黏膜和血管的损伤，与临床致病因素有较大差异，且最初黏膜损伤的非特异性炎症呈现急性过程，不能表现人类UC所具有的慢性，复发的特点[9]。

2.1.2 DSS法

葡聚糖硫酸钠 (dextran sulphate sodium,DSS) 是一种肝素样硫酸多糖体，1958 年Ohkusa[10]最早利用仓鼠建立，闫曙光[11]采用2%葡聚糖硫酸钠口服2周建立溃疡性结肠炎小鼠模型，Trivedi [12]通过给Swiss小鼠连续7d自由饮用3.0%DSS水溶液，之后连续14d给予普通饮水，最后再连续7d给予3.0%DSS水溶液建立DSS的慢性UC模型。但是DSS诱导的溃疡模型个体差异比较明显，且为短期急性模型，不适宜研究慢性UC引发的结肠癌相关问题。

2.2 复合法

2.2.1 恶唑酮模型(oxazolone,OXZ)+乙醇

恶唑酮是一种半抗原物质[13]，其诱导UC模型先致敏然后进行灌肠给药，用恶唑酮溶液对小鼠灌肠,小鼠5d后即可出现肠道炎症[14]，结肠肉眼可见黏膜充血水肿, 糜烂溃疡, 镜下见结肠黏膜溃疡。7d左右病情好转，10d左右基本痊愈。利用恶唑酮建立溃疡性结肠炎模型，速度较快，重复性好且制作简单，但是疾病维持时间相对较短，小鼠模型有自愈倾向，缺少慢性过程，对于慢性复发性溃疡性结肠炎的模拟度不高。

2.2.2 三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)+乙醇

采用异戊巴比妥麻醉，一定量TNBS缓慢灌肠可以诱导急性肠炎Wistar大鼠模型；15d以后再次给予定量TNBS灌肠可以造成复发性结肠炎，可以造成复发性结肠炎[15-16]，三硝基苯磺酸与乙醇灌肠一次致炎是目前最为常用的溃疡性结肠炎模型建立方法，具有以上其他建模方法所没有的优点。

2.3 免疫复合法

2.3.1 免疫复合物+TNBS+乙醇

谭琰等[17]实验证实，与TNBS+乙醇诱导的结肠炎动物模型相比，增加免疫复合物进行复合诱导的方式更符合T/B淋巴细胞混合作用的要求，而且炎症持续的时间延长了3~4个星期。崔国宁[18]研究免疫复合法建立的大鼠UC模型表现稳定，重复性好，病变持久，发病机制与人类UC相似，是较为理想的模型。康宜兵等[19]研究示免疫复合建立的模型成功率高，重复性好，与人类的UC相似，是较为理想的模型。具体方法：取20只SD大鼠，随机分为模型组和空白组，每组各10只，模型组给予抗原乳化液于大鼠的背部、颈部皮下，第23天灌肠TNBS/50%乙醇，空白组以生理盐水代替，比较各组大鼠的大便性状、体重、便血等，并进行组织学检查。由此可以看出，本法建立大鼠 UC 模型持续的时间长，溃疡的形成，与炎性反应都有体现，符合临床UC的病理要求，但缺点是比较繁琐。

2.3.2 免疫复合物+乙酸

吴玉泓[20]采用局部乙酸刺激替代TNBS+乙醇灌肠，免疫致敏方法与上述相似，同样起到了模拟人类UC慢性活动性的特点，也适宜于观察和评价药效。

2.4 讨论

UC模型最常见的造模方法为化学法、复合法及免疫复合法等，DSS液、TNBS液是化学法中最常用的诱导剂，对造模成功与否所用到的评价指标主要有：疾病活动指数、结肠指数、结肠组织大体评分[21-22]、MPO酶活性检测[23]，以及形态学观察和免疫组化学染色细胞观察[24-25]等。目前对于溃疡性结肠炎动物模型的诱导大部分属于急性病发式炎症，偶有慢性模型诱导的方法，虽然现在建造UC动物模型的方法多种多样，但是依旧存在着或多或少的缺陷，现阶段的UC模型远不能满足科学研究的需要，故寻找更好，更方便，更符合人类溃疡疾病的模型尤为重要。本实验方法[26-27]将OXZ与TNBS联合灌肠给药，按照一定周期诱导小鼠溃疡性结肠炎模型可维持一个月，使UC模型更接近人类UC发病机制及临床症状，通过控制小鼠的性别、体重、健康饲养状况、实验环境与条件等环节，观察小鼠的行为改变情况、免疫组化、炎症因子的表达情况，为进一步研究UC的发病机制，防治方法提供符合临床实际的、标准的、可重复的、可控易行的实验动物模型，为慢性溃疡性结肠炎模型的研究提供了可靠的数据支持和实验依据，是临床UC治疗药物研究的重要基础。

参考文献

[1] 张晶娜,陶磊,张俊,王木岭,陈莹,刘衡,张成桂,何苗.美洲大蠊提取物Ento-A对湿热型溃疡性结肠炎模型大鼠的改善作用研究[J].中国药房,2020,31(01): 35-41.

[2]赵曼, 高峰. 溃疡性结肠炎发病机制研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2010, 10(16): 3160-3165.

[3]Lakatos PL, Lakatos L. Risk for colorectal cancer in ulcerative colitis:changes, causes and management strategines [J]. World J Gastroenterol, 2008,14(25): 3937-3947.

[4]郭 倩, 唐志鹏, 王丽娟. 溃疡性结肠炎组织病理学诊断的研究进展[J]. 世界华人消化杂志, 2014, 22(2): 190-196.

[5]郑文潇,吴翔.溃疡性结肠炎动物模型的研究进展[J].中国病原生物学杂志,2016, 11(09):861-864+867.

[6]杨永刚,王丹丹,张艳秋,王明星.猴头菌多糖对溃疡性结肠炎模型大鼠肠道短链脂肪酸含量的影响[J].中国药房,2019,30(20):2763-2767.

[7]张忠,程富胜,贾宁,车清明,尹凤琴,祝艳华.小鼠溃疡性结肠炎模型的建立及病理组织学比较[J].中国实验动物学报,2012,20(06):69-72+99.

[8]张晓峰.细胞因子与溃疡性结肠炎[J].河北医学, 2001, 7 (5) :465-467.

[9]霍丽娟, 赵和平.实验性溃疡性结肠炎大鼠模型的研究[J].山西医科大学学报, 2004, 35 (5) :467-470.

[10] 闫曙光,惠毅,李倩,李京涛,魏海梁.黄连-干姜提取物对溃疡性结肠炎小鼠结肠上皮TLR4/NF-κB信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(04): 70-75.

[11]Ohkusa T. Production of experimental ulcerative colitis in hamsters by dextransulfate sodium and changes in intestinal microflora[J].Nihon Shokakibyo GakkaiZasshi,1985,82(5):1327-36

[12] Trivedi PJ,Bruns T,Ward S,et al.Intestinal CCL25expression is increased in colitisand correlates with inflammatory activity[J].J Autoimmun,2016(68): 98-104

[13] Friedlaender M H, Cyt R, Contactsensitivity in the guinea pig eye[J].Curr Eye

Res,1981, 1 (7) :403.

[14] 沈可欣,马淑荣,李岩,等.恶唑酮诱导小鼠炎性肠病模型的建立[J].中国实验诊断学,2012(10):1804-6.

[15] Wang YH,Ge B,Yang XL,etal.Proanthocyanidins from grape seeds modulates the nuclear factor-kappa Bsignal transduction pathways in rats with TNBS-induced recurrent ulcerativecolitis[J].Int Immunopharmacol,2011,11 (10):1620-7.

[16] Li XL,Cai YQ,Qin H,et al.Therapeuticeffect and mechanism of proantho- cyanidins from grape seeds in rats withTNBS-induced ulcerative colitis[J].Can J Physiol Pharmacol,2008,86(12):841-9.

[17]谭琰,三硝基苯磺酸/乙醇与免疫复和物联合诱导的结肠炎动物模型及其免疫机制的探讨[D].华中科技大学,2008.

[18]崔国宁,刘喜平,董俊刚,曾庆涛.溃疡性结肠炎模型建立方法研究进展[J].今日药学,2018,28(04):280-284.

[19]康宜兵,吕永慧,吴宇金,钟志勇,武昕.免疫复合型溃疡性结肠炎大鼠模型的实验研究[J].云南中医中药杂志,2015,36(10):55-57.

[20]吴玉泓,李海龙,段永强,吴建军,王宏伟,魏彦明.免疫致敏结合局部乙酸刺激法建立大鼠溃疡性结肠炎模型[J].中国实验动物学报,2010,18(01):65-68+65.

[21]Graeme P Young，D.James B.St John，Sidney J Winawer，et al.Choice of fecal occult blood tests for colorectalcancer screening: recommendations based on performance characteristics inpopulation studies[J]. The American Journal ofGastroenterology. 2002 (10)

[22]Wang Zhi-xue，DongBing，Feng Zi-fang，et al. A study on immune- omodulatory mechanism ofpolysaccharopeptide mediated by TLR4 signaling pathway[J]. BMC Immunol，2015，16（1）：34.

[23]Itana de Mattos，Pintoe Passos，Renata Lopes Britto.Diagnosisand treatment of müllerian malformations[J].Taiwanese Journal of Obstetrics & Gynecology, 2020, 59(2).

[24]徐立,胡瑞斌,李兆波,等. STZ诱导糖尿病大鼠胰腺及肝脏石蜡切片HE染色改进方法[J].临床与实验病理学杂志,2019,35(09):1122-1124.

[25] Hilip Alex，Nicholas C Zachos，Thuan Nguyen，et al. Distinct cytokinepatterns identified from multiplexprofiles of murine DSS and TNBS-induced colitis[J]. NIH Public AccessAuthor Manuscript，2009，15（3）：341-352.

[26]宋晓敏,张丹参,庄忠宝,张海威,苏晓梅,赵凯燕,张力.噁唑酮与三硝基苯磺酸联用诱导小鼠慢性溃疡性结肠炎模型[J].神经药理学报,2016,6(03):17-23.

[27] 张丹参,王倩,田慧,薛贵平,张力.大黄栓制剂对两种溃疡性结肠炎模型小鼠的作用研究[J].神经药理学报,2015,5(01):19-37.

本实验采用昆明种6-8周龄的健康成年小鼠，体重均在33±2g，SPF级。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京斯贝福生物科技股份有限公司，动物用水为实验室制UP水经过除菌处理。饲养及实验操作均于具有检验合格资质的SPF级屏障动物室内进行，并且实验动物以完整的包装直接进入屏障实验室，观察室适应7天后无异常情况，方可进行实验。所有实验中小鼠均引颈处死，尽量减少动物手术创伤程度及失血量。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。