辐射诱导小鼠肺损伤模型

一、疾病概述

放射性肺损伤（Radiation-inducedPulmonaryInjury）又称放射性肺炎（radiation pneumonia），是由于对胸部的恶性肿瘤进行放射治疗引起的并发症，最多见于对肺癌、乳腺癌，其次是对食管癌、纵隔恶性肿瘤的放疗。放射治疗后在放射野内的正常肺组织受到损伤而引起的炎症反应。轻者无症状，炎症可自行消散；重者肺脏发生广泛纤维化，导致呼吸功能损害，甚至呼吸衰竭。

1 病因 肺经照射后，电离辐射产生的自由基损伤肺泡上皮和毛细血管内皮细胞的细胞膜和DNA，导致细胞功能不良和死亡是照射后致肺组织损伤的直接原因；同时，照射引起照射野局部细胞因子含量增多，成纤维细胞生长因子和趋化因子共同作用于照射区，使肺组织产生损伤，最终导致肺纤维化和肺硬化。

2.病理改变 急性期的病理改变多发生于放射治疗后1～2月，表现为肺血管，特别是毛细血管损伤产生充血、水肿和细胞浸润，肺泡Ⅱ型细胞再生低下，淋巴管扩张和透明膜形成。急性变化有可能自行消散，但常引起肺结缔组织增生，纤维化和玻璃样变。慢性期往往发生于放射治疗9个月以后，病理为广泛肺泡纤维化，肺脏收缩，毛细血管内膜增厚、硬化，管腔狭窄或阻塞而导致肺循环阻力增高和肺动脉高压。胸膜也可因炎变和纤维化而增厚。细支气管粘膜上皮间变，肺继发性感染，可促进放射性纤维化。

3.临床表现 轻者无症状，多于放射治疗后2～3周出现症状，常有刺激性、干性咳嗽，伴气急、心悸和胸痛，不发热或低热，偶有高热。气急随肺纤维化加重呈进行性加剧，容易产生呼吸道感染而加重呼吸道症状。并发放射性食管炎时出现吞咽困难。若放射损伤肋骨，产生肋骨骨折，局部有明显压痛。体检见放射部位皮肤萎缩、变硬，肺部可闻及干、湿罗音和磨擦音。肺部广泛、严重纤维化，最后导致肺功能高压及肺源性心脏病，出现相应征象。

4.检查手段

1）X线胸片：急性放射性肺炎发生于放疗近结束时至放疗后2个月内，肺放射野内呈片状均匀密度模糊影，多发边界不清的小斑片状阴影，病灶边缘与放射野一致，与正常肺组织有明显分界，此为本病特征表现。

2）肺功能改变：肺放射性肺炎和纤维化都引起限制性通气功能障碍，肺顺应性减低，伴通气/血流比例降低和弥散功能减低，导致缺氧。有时胸片尚未发现异常，而肺功能检查已显示变化。

5.诊断与鉴别诊断 根据放射治疗史，干性呛咳，进行性气急和胸部X线有炎症或纤维化改变可作出诊断，但应与肺部肿瘤恶化和转移性肿瘤相鉴别，支气管粘膜上皮经照射后常引起细胞间变，应与癌肿细胞相区别。

6.治疗原则 主要是对症治疗，对仅有影像学表现而无临床症状者，不予特殊治疗；若有咳嗽、咳痰，对症治疗；肺部继发感染给予抗生素，早期应用糖皮质激素有效，抗凝疗法治疗小血管栓塞无效，给予氧气吸入能改善低氧血症。有清热解毒、养阴益气和活血化瘀功效的中药具有不同程度的预防和治疗放射性肺炎的作用，与西药合用，能明显缓解症状，改善放疗后肺纤维化的病理改变，加速肺功能的恢复。

7.预防 为预防放射性肺炎的发生，应科学合理制定放疗方案，尽可能缩小照射面积，减少对正常肺组织的照射剂量。在放射治疗过程中，应严密观察患者有无呼吸道症状及体温升高。X线检查发现肺炎，应立即停止放射治疗。

参考文献

1. 刘树铮, 主编. 医学放射生物学. 第3版. 北京: 原子能出版社, 2006.

2. 殷蔚伯,主编.肿瘤放射治疗学.第4版.北京: 中国协和医科大学出版社,2008.

二、模型背景

1、实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠。

2、研究背景

放射性肺损伤是胸部放射治疗的重要限制因素。尤其是放射性肺纤维化可以导致患者呼吸困难甚至严重的呼吸功能不全，使放疗患者生活质量严重下降。根据判断终点及影响因素的不同，放射性肺纤维化发病率报道的波动范围很大，可以从1%至43%。目前放射性肺纤维化发病机制尚未阐明，临床上也缺乏明确的早期诊断和有效治疗方法，发病患者预后很差，因此对放射性肺纤维化机制的研究及防治药物的研发一直是临床亟需解决的问题，也是当前的研究热点。

建立放射性肺损伤动物模型对于发病机制研究、研发适用于临床的预测性生物标志物和有效的治疗药物具有重要的意义。研究使用最多的是在啮齿类动物模型，目前认为C57BL/6小鼠对放射性肺纤维化比较敏感。由于辐照设备的改善，可以进行小动物双肺或单肺的局部照射制备模型。因为实验室条件及实验动物采用的照射剂量、放射性肺损伤出现的性质及程度略有差异；模型评价指标多以受照动物生存期和肺部病理改变为主。这与临床上放射性肺炎及纤维化形成多伴有胸膜症状不一致；临床检测包括有胸部影像学检查、肺功能检查在小鼠模型上难以操作。这可能是影响防治措施研究的临床转化的原因之一。

参考文献：

1.陈孟毅，孟爱民. 肺纤维化动物模型及研究进展. 中国比较医学杂志，2016, 26(6):88-93

2.MacVittie TJ, Farese AM, Parker GA, Bennett AW,Jackson WE 3rd. Acute Radiation-induced Lung Injury in the Non-human Primate: AReview and Comparison of Mortality and Co-morbidities Using Models ofPartial-body Irradiation with Marginal Bone Marrow Sparing and Whole ThoraxLung Irradiation. Health Phys. 2020 Nov;119(5):559-587. doi:10.1097/HP.0000000000001346. PMID: 33009295.

3.Ghita M, Dunne V, Hanna GG, Prise KM, WilliamsJP, Butterworth KT. Preclinical models of radiation-induced lung damage: challengesand opportunities for small animal radiotherapy. Br J Radiol. 2019Mar;92(1095):20180473. doi: 10.1259/bjr.20180473. Epub 2019 Feb 13. PMID:30653332; PMCID: PMC6541188.

4.Dabjan MB, Buck CM, Jackson IL, Vujaskovic Z,Marples B, Down JD. A survey of changing trends in modelling radiation lunginjury in mice: bringing out the good, the bad, and the uncertain. Lab Invest.2016 Sep;96(9):936-49. doi: 10.1038/labinvest.2016.76. Epub 2016 Aug 1. PMID:27479087.

1. 实验材料 C57BL/6雄性小鼠（SPF级）由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，合格证号[SCXK(京)2015-0035]，体重20.0-22.0 g，周龄8-12。

2. 照射条件 X线生物辐照仪（RS2000，美国Rad Source Technologies）照射，照射剂量为17 Gy，剂量率为3.12 Gy/min。照射面积为1.5 cm2，源皮距为15 cm。

3. 组织处理、切片 C57小鼠肺组织取材固定于4% 的中性甲醛24 h，修块至肺组织最大横截面，脱水后制作石蜡块。用石蜡组织切片机制作4 µm的切片，切片常规HE染色、Masson染色、免疫组织化学，封片后用正置显微镜（BX51，Olympus，Japan）观察。

4.HE染色 组织切片在病理平台进行苏木素-伊红常规染色。HE染色后进行镜下观察。病理学镜检人员对小鼠受照侧肺组织组织切片进行单盲评分。来自于动物的右肺的全部被检玻片均随机化检测。这一评分系统由一个0~12分范围的可数评分组成，每张切片，由肺泡间隔增宽、肺泡腔内纤维化渗出的严重度、血管周围炎细胞浸润的程度进行分类评分，每种分类根据病变程度又分为：0分为正常；1分为轻度；2分中度；3分重度；4分极重度。合并后记分。

5.Masson染色 肺组织切片在病理平台常规处理，进行Masson复合液染色，结果细胞核染黑蓝色，胶原纤维呈绿色，神经胶质纤维、肌纤维、红细胞呈红色。图像用单反数码相机（D90，Nikon，Japan）进行采集，肺组织横截面积用Image-Pro Plus5.1（IPP，Media Cybernetics，Inc. USA）软件进行计算，结果用胶原沉积面积占组织总面积的比值表示。

6.肺羟脯氨酸含量测定 冷冻肺组织制备匀浆。使用羟脯氨酸比色分析试剂盒（BioVision，Milpitas，CA）测量匀浆中的胶原蛋白含量。数据以每毫克肺匀浆蛋白质的微克羟脯氨酸表示。

7.小鼠纤维化相关基因PCR检测 于照射后8周、16周、23周取小鼠右肺中叶，每组3只，迅速保存于-80℃冰箱，样本处理后按照试剂盒提供的实验步骤进行基因表达测定分析。

1．小鼠右肺局部照射后不同时间小鼠皮毛损伤性改变

小鼠右侧肺部受到17 Gy照射，表皮会受到不同程度的损伤，白化损伤区域和照射区域重合，表明照射定位准确（图1）。如果出现局部破损及炎症时给予抗生素软膏涂抹。

2. 小鼠右肺局部照射对肺组织结构的影响

小鼠受照侧肺组织HE染色后进行镜下观察。病理学镜检人员单盲对组织切片进行评分。结果显示小鼠右肺受照后8周开始病理评分增高，表明小鼠右肺局部照射发生明显病变，并且呈进行性加重(见图2)。

图2小鼠右肺局部照射对肺组织结构的影响。图A为镜检HE染色，100倍；图B为肺组织病理学评分。肺组织病理学评分用mean±SE表示，n=6，a：与Control组相比p<0.01。

3. 小鼠右肺局部照射对肺组织胶原生成的影响。

观察小鼠右肺局部照射后不同时间点对肺组织胶原生成的影响，结果显示Control组小鼠肺组织几乎看不见阳性着色。受照组小鼠肺组织胶原沉积阳性着色面积比增高，纤维化程度增高。表明小鼠右肺局部照射后肺组织中胶原沉积面积增大，并且呈进行性加重（图3A、B）。肺组织羟脯氨酸测定呈现相同趋势（图3C）。肺组织纤维蛋白相关基因表达水平受照后逐渐升高（图3D、E）。上述结果提示小鼠右肺局部照射导致肺纤维化的模型成立。

图3 受照后肺组织增生性改变（A，B）受照肺组织Masson染色及评分； C 受照肺组织羟脯氨酸含量测定；（D，E）肺组织细胞内纤维沉积相关因子mRNA的表达水平。

a，与control (CTL)相比 P<0.05；b, 与受照后(IR)8周组相比 P<0.05; c, 与受照后16周相比P<0.05

模型成立的指标包括：1）小鼠接受大剂量（17Gy）胸部局部照射；2）受照后16周后受照肺组织进行镜下病理观察，HE染色呈现纤维增生状态，病理评分明显升高；Masson染色绿色胶原沉积增多；肺组织匀浆检测羟脯氨酸含量升高。3）进行评价时也可以观察受照后小鼠30周存活率（非特异性指标）；4）有条件时可以进行小鼠MicroCT胸部成像进行近期和远期观察。

制备动物模型使用的小动物照射设备自身带有防护设施，使用安全。