SHIV-1157ipd3N4阴道途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(Acquired ImmunodeficiencySyndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研究、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV与SIV毕竟是两种不同的病毒，它们在基因序列、包膜结构和抗原性之间存在一定差异，使该模型的使用有一定的局限性。近年来，人们应用分子生物学技术，将HIV-1重要基因与SIV做成嵌合体病毒（SIV/HIV-1，简称为SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。

R. M. Ruprecht以SHIV-KB9为骨架构建了表达HIV-1 C亚型env的SHIV-1157i，并经静脉途径感染印度恒河猴得到SHIV-1157ipd3N4。它所具有高度复制能力的、CCR5受体嗜性、经粘膜传播这些特性，使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为模拟异性间性传播的感染方式，通过阴道粘膜上皮途径接种病毒，病毒可能直接感染郎格汉斯细胞、上皮细胞等。在灵长类动物AIDS模型的研究中发现体内注入黄体酮可促进SIV/SHIV传播，而雌激素则抑制SIV/SHIV传播，可能与这些激素能影响阴道壁厚度或通过IL-2等影响CCR5和CXCR4受体表达有关。在合适的生理周期或使用一定量的黄体酮的情况下，用导尿管将病毒缓慢注入猴阴道内，可建立异性性传播动物模型。

1、 实验用病毒：感染毒株SHIV-1157ipd3N4，病毒原液滴度为1×106 TCID50/mL（TZM-bl细胞滴定）。

2、感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：将麻醉好的实验猴放在操作台上，动物采取俯卧位，后肢抬高，暴露阴道口。用2mL预冷的无菌PBS清洗阴道。再将稀释好的适当浓度的病毒液1mL缓慢推入。实验猴保持此姿势30min。

4、 SHIV-1157ipd3N4阴道感染猴样品采集和指标测定：感染采取小量多次的方法,共感染11次。前3次使用20TCID50的SHIV1157ipd3N4病毒,后8次使用10TCID50的病毒，间隔4-8d，进行阴道感染。在每次感染前及11次感染结束后定期采EDTA抗凝血3ml，分别测定CD348及血浆病毒载量。

5、 SHIV-1157ipd3N4阴道感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA,使用SYBRGreen I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SHIV-1157ipd3N4阴道感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

1、SHIV-1157ipd3N4阴道感染恒河猴外周血病毒载量结果

7-1到7-5猴都在初次感染后11d出现血浆病毒载量，高峰期载量都在106copies/mL以上，其中3只在107copies/mL以上。7-2和7-5在初次感染后38d血浆病毒载量转阴，且持续至感染后111d，急性期病毒载量只维持了20d。其余3只猴7-1，7-3，7-4急性期时间较长，且维持在104copies/mL左右。7-6在初次感染后63d首次检出血浆病毒载量，高达3.336×107copies/mL，至139d转阴（图1）。

图1 SHIV-1157ipd3N4小剂量多次阴道途径感染中国恒河猴血浆病毒载量结果

Fig.1 The viremia(viral RNA copies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaques infected IVAGwith repeated low dose of SHIV-1157ipd3N4

1、 SHIV-1157ipd3N4阴道感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值结果

6只实验猴的CD4+/CD8+比在病毒载量出现后均有一个短期内快速下降并迅速反弹的过程。除7-4和7-6外，其他4只实验猴均未出现明显倒置，但CD4+/CD8+比值有逐渐降低的趋势。7-4在载量高峰时CD4+/CD8+降到了0.5，反弹后在70d再次降到0.5并逐渐维持在这个水平上。7-6在载量高峰时（70d）CD4+/CD8+降到了0.62，随后逐渐上升，至110d时已恢复至1.0左右（图2）。

图2SHIV-1157ipd3N4小剂量多次阴道途径感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2The changes of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytes in Chinese-original rhesus macaques infected IVAGwith repeated low dose of SHIV-1157ipd3N4

1、 SHIV-1157ipd3N4阴道感染恒河猴外周血CD4+T细胞绝对数结果

7-1到7-6实验猴的CD4+细胞绝对数在感染50天内都基本保持稳定，在1000个/µL全血上下浮动，随后均有逐步下降，但下降幅度不大，最低值始终在600以上（具体数据未显示）。只有7-1从77d起有一次大幅下降，到感染后98d时，已降到222个细胞/µL猴血（见图3），随后迅速反弹至1000以上（图3）。

图3SHIV-1157ipd3N4小剂量多次阴道途径感染恒河猴外周血CD4+T细胞绝对数变化

Fig.3 The CD4+ T cell counts (per l blood) inChinese-original rhesus macaques infecte IVAG with repeated low dose of SHIV-1157ipd3N4

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。