SHIVSF162P3直肠途径感染恒河猴模型

一、 艾滋病概述

艾滋病(AcquiredImmunodeficiency Syndrome, AIDS)，是由人免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus, HIV）引起，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病，是20世纪危害人类健康和生命最严重的病毒性疾病之一。自美国CDC报道首例艾滋病后，到20世纪80年代中期艾滋病发展成为一个性的流行病。截止2014年底，HIV已感染3690万人，2014年新增感染者200万，2014年因艾滋病死亡120万人。艾滋病在1985年传入我国，截至2015年5月31日，历年累计报告艾滋病530628例，其中艾滋病病人217457例，死亡167159例。艾滋病早已成为关注的公共卫生和社会热点问题，艾滋病的预防与治疗也成为当代生物医学研究的前沿热点之一。

二、艾滋病动物模型简介

艾滋病发病机制研究、药物和疫苗的保护性研究及评价等方面在很大程度上依赖理想的动物模型。SIV/SAIDS(猴艾滋病)模型被广泛接受和应用，表现为和AIDS的临床表征，发病过程、免疫缺陷特征等非常相似。然而，由于HIV与SIV毕竟是两种不同的病毒，它们在基因序列、包膜结构和抗原性之间存在一定差异，使该模型的使用有一定的局限性。近年来，人们应用分子生物学技术，将HIV-1重要基因与SIV做成嵌合体病毒（SIV/HIV-1，简称为SHIV）感染恒河猴，用以研究HIV不同基因的功能以及病毒与宿主的相互作用。

美国洛克菲勒大学的Aaron Diamond 艾滋病研究中心Cecelia教授以SIVmac239为骨架替换HIV-1SF162（R5,MT/NSI）的env, tat, rev, vpu等基因构建了表达HIV-1B亚型env的SHIVSF162PC，经恒河猴体内传代得到SHIVSF162p3。它具有高度复制能力、CCR5受体嗜性，并且能经粘膜传播，这些特性使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。

艾滋病的三种传播途径分别是经血液、性和母婴传播，性传播包括同性传播和异性传播两种方式。艾滋病动物模型的制备首先要考虑其实际应用价值，最好的动物模型可以最大限度的模拟人类疾病，包括使用与自然感染相同或接近的方式建立模型。为模拟同性间性传播的感染方式，通过直肠粘膜上皮途径感染，病毒直接感染M细胞、上皮细胞等。直肠的生理构造及上皮细胞厚度非常薄等特点，都使直肠感染较阴道感染容易发生。将病毒缓慢注入猴直肠内，可建立同性性传播动物模型。

1、 实验用病毒：感染毒株为SHIVSF162p3中国恒河猴细胞适应株，中国恒河猴PBMCs滴定病毒原液TCID50滴度为1×104 TCID50/mL。

2、 感染动物：选用体重4-6kg的SPF恒河猴。实验前体检无异常，必须排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D型病毒(SRV-1，2，5)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒（SIV）易感性密切相关的4种基因（Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17）筛查结果为阴性。所有感染动物必须在ABSL-3室中进行。

3、 感染方法：将麻醉好的实验猴放在操作台上，动物采取俯卧位以保证直肠粘膜充分暴露，缓慢将SHIVSF162p3中国恒河猴细胞适应株的稀释液注入肛窦处，实验猴保持此姿势30min。

4、 SHIVSF162p3直肠感染猴样品采集和指标测定：感染采取小量多次的方法，共感染21次。前3次接种的病毒浓度为1 TCID50/mL，然后2 TCID50/mL接种3次，10 TCID50/mL接种3次，20 TCID50/mL接种3次，最后30 TCID50/mL接种5次，每次接种间隔4-7d。在每次感染前及21次感染结束后,采EDTA抗凝血3mL，分别测定外周血CD4+/CD8+比值及血浆病毒载量。

5、 SHIVSF162p3直肠感染猴血浆病毒载量的测定：提取EDTA抗凝血浆中病毒RNA，使用SYBR Green I 实时荧光定量RT-PCR方法测定血浆病毒载量。

6、 SHIVSF162p3直肠感染猴外周血CD4+/CD8+比值及绝对数测定：CD3-PerCP、CD4-FITC、CD8-PE抗体标记EDTA抗凝全血淋巴细胞，流式细胞仪测定CD4+/CD8+比值，并根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数。

1、SHIVSF162p3直肠感染恒河猴外周血病毒载量结果

G0812R与G0821R载量峰值最高，分别为为106和106.5拷贝/ml，而G0813R、G0814R、G0815R、G0817R和G0819R载量峰值较低，介于103～105拷贝/ml之间（图1）。

图1 SHIVSF162p3小剂量多次直肠途径感染恒河猴血浆病毒载量结果

Fig.1 The viremia (viral RNAcopies/ml plasma) in Chinese-original rhesus macaques infected intrarectallywith repeated low dose of SHIVSF162p3

1、 SHIVSF162p3直肠感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值结果

7只实验猴的CD4+/CD8+比值在某一段时间内均有明显下降的趋势。G0813R和G0821R两只猴的CD4+/CD8+比值从感染初期的2.0左右，到感染100天后逐渐下降至1.0左右，其中，G0821R猴在感染后158天出现倒置；G0819R和G0817R两只猴的CD4+/CD8+比值在感染后100天左右下降至1.0以下，出现倒置，随后发生反弹；G0812R、G0814R和G0815R三只感染猴均在感染后100天，CD4+/CD8+比值下降至1.0以下，之后维持倒置现象（图2）。

图2 SHIVSF162p3小剂量多次直肠途径感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值

Fig.2 Thechanges of CD4+/CD8+ ratio of T lymphocytesin Chinese-original rhesus macaques infected intrarectally with repeated lowdose of SHIVSF162p3

1、 SHIVSF162p3直肠感染恒河猴外周血CD4+T细胞绝对数结果

7只实验猴的CD4+细胞绝对数在感染88天内都基本保持稳定，在1000-2000个/µL全血上下浮动，没有明显的升高或降低（图3）。

图3 SHIVSF162p3直肠途径感染恒河猴外周血CD4+T细胞绝对数的变化

Fig.3 The CD4+ T cell countsin Chinese-original rhesus macaques infected intrarectallywith repeated low dose of SHIVSF162p3

1.该模型制备比较成熟，国内外都有此模型，构建和评价指标一致，所以该模型应用广泛，具有统一的操作规程。

2. 该模型制备的关键：1）小鼠必须是重度免疫缺陷的，而且饲养环境必须洁净；2）HIV操作需要生物安全。

3.此模型具有完善的人的免疫系统，HIV感染后，具有艾滋病病人相似的临床症状，所以具有很高的比较医学应用价值。